Detection of antigens in paraffin sections of worms and snails infected by Angiostrongylus cantonensis by immunofluorescence reaction / Detecção de antígenos em cortes parafinados de vermes e caramujos infectados por Angiostrongylus cantonensis pela reação de imunofluorescência

The Indirect Immunofluorescence Assay (IFA) was used to identify stage-specific antigenic structures in paraffin sections of female larvae and worms and snails tissues, infected with third stage larvae of Angiostrongylus cantonensis. Sera from eosinophilic meningitis cases were used to assess reactivity. Non-reactive sera from patients with other parasitic diseases and from individuals without other etiologies were used as controls for cross-reactivity. Larvae and worms showed high reactivity to IgG antibodies. IgM antibodies reacted with low intensity only to larvae. Fluorescent reactions were observed in the cuticles and internal structures on worms sections, with a marked reaction in the uterus content. In the snail tissues, the larvae were found exclusively inside the granulomas, with fluorescent markings in the cuticles of the larvae and inside the granulomatous tissues. This fluorescent pattern suggests the presence of excretory/secretory antigens distributed throughout the granulomas. Expressive cross-reactivity occurred in sera from patients with other parasitic diseases, especially strongyloidiasis. The use of IFA applied to paraffin sections to identify structures with antigenic potential and the study of new serological markers, can contribute to the improvement of the laboratory diagnosis of eosinophilic meningitis. (AU)

A Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) foi utilizada para localizar antígenos em estruturas estágio-específicas em cortes parafinados de vermes fêmeas e em tecidos de caramujos do Gênero Biomphalaria infectados com larvas de terceiro estágio de Angiostrongylus cantonensis. Soros de casos confirmados de meningite eosinfílica foram usados para avaliação da reatividade. Soros não reagentes de casos suspeitos; de pacientes com outras parasitoses e de indivíduos sem outras etiologias foram utilizados como controle de reatividade cruzada. Anticorpos da classe IgG foram reativos para antígenos presentes nos dois estágios e, anticorpos IgM somente para o estágio larvário. Nos cortes de vermes, as marcações fluorescentes foram assinaladas nas cutículas e estruturas internas, com acentuada marcação para os conteúdos uterinos. Nos tecidos dos caramujos as larvas foram encontradas exclusivamente no interior dos granulomas, com marcações fluorescentes nas cutículas das larvas e no interior dos tecidos granulomatosos. O padrão de fluorescência no granuloma sugere a marcação de antígenos excretores/secretores. Reatividade cruzada mais expressiva ocorreu com anticorpos presentes em soros de pacientes com outras parasitoses, com destaque para estrongiloidíase. A RIFI em cortes parafinados abre novas perspectivas para identificação de antígenos e de marcadores sorológicos, que possam ser aplicados no aprimoramento do diagnóstico laboratorial da meningite eosinofílica. (AU)

Anti-DENV-NS1 monoclonal antibody for the differential histopathological diagnosis of hemorrhagic fever caused by dengue

Dengue is the most prevalent arboviral disease in humans in tropical and subtropical regions, especially in urban areas, and can cause major epidemics. Although a self-limiting illness, it may sometimes have serious hemorrhagic manifestations, and the outcome of dengue hemorrhagic fever has similar clinical manifestations as in other infections, which could result in death. Therefore, autopsy procedures are required under certain circumstances such as in hemorrhagic fevers, sometimes to confirm or to clarify the diagnosis that may have epidemiological consequences. Normally, the Immunohistochemistry Laboratory of the Pathology Center of Adolfo Lutz Institute receives autopsy samples from different hospitals in Sao Paulo State to confirm a previous diagnosis, especially hemorrhagic fever of infectious etiology. For this diagnosis, we have been using a mouse polyclonal antibody to dengue virus that often does not provide a clear conclusion, because of background staining or no relevant immunostaining, which hampers the histopathological analysis. Accordingly, in the present study, anti-DENV-NS1 monoclonal antibody (4H2) was tested to determine its accuracy in immunohistochemical analysis. Twenty-four autopsy cases of hemorrhagic febrile syndrome showing histopathological alterations compatible with dengue disease were studied: twenty cases were confirmed by RT-PCR for DENV-2 and in four by RT-PCR for yellow fever virus. Samples from autopsied cases of deaths caused by other infectious diseases (two meningitis C and two severe acute respiratory syndrome caused by influenza A H1N1) were included as negative control cases. Positive immunostaining for DENV-NS1 was detected in 16/20 (80%) liver samples and 11/15 (73%) spleen samples from autopsied hemorrhagic dengue patients, whereas the polyclonal antibody detected DENV antigens in 12/20 (60%) liver and in 6/15 (40%) spleen samples from the same cases. Positive results were not obtained with liver biopsy samples from yellow fever or Neisseria meningitides and Flu-A cases. 4H2 mAb recognizes the native protein of the four DENV serotypes in infected cells and did not cross-react with native ZIKV- or CHKV-infected cells by immunohistochemical assay, so it is a useful tool for differential histopathological conclusion of acute febrile hemorrhagic deaths.

Salivary glands are a target for SARS-CoV-2: a source for salivacontamination

The ability of the new coronavirus SARS-CoV-2 to spread and contaminate is one of the determinants of the COVID-19 pandemic status. SARS-CoV-2 has been detected in saliva consistently, with similar sensitivity to that observed innasopharyngeal swabs. We conducted ultrasound-guided postmortem biopsies in COVID-19 fatal cases. Samples ofsalivary glands (SGs; parotid, submandibular, and minor) were obtained. We analyzed samples using RT-qPCR, immu-nohistochemistry, electron microscopy, and histopathological analysis to identify SARS-CoV-2 and elucidate qual-itative and quantitative viral proles in salivary glands. The study included 13 female and 11 male patients, with amean age of 53.12 years (range 8­83 years). RT-qPCR for SARS-CoV-2 was positive in 30 SG samples from18 patients (60% of total SG samples and 75% of all cases). Ultrastructural analyses showed spherical 70­100 nm viral particles, consistent in size and shape with the Coronaviridae family, in the ductal lining cell cytoplasm,acinar cells, and ductal lumen of SGs. There was also degeneration of organelles in infected cells and the presence of acluster of nucleocapsids, which suggests viral replication in SG cells. Qualitative histopathological analysis showedmorphologic alterations in the duct lining epithelium characterized by cytoplasmic and nuclear vacuolization, as wellas nuclear pleomorphism. Acinar cells showed degenerative changes of the zymogen granules and enlarged nuclei.Ductal epithelium and serous acinar cells showed intense expression of ACE2 and TMPRSS receptors. An anti-SARS-CoV-2 antibody was positive in 8 (53%) of the 15 tested cases in duct lining epithelial cells and acinar cellsof major SGs. Only two minor salivary glands were positive for SARS-CoV-2 by immunohistochemistry. Salivaryglands are a reservoir for SARS-CoV-2 and provide a pathophysiological background for studies that indicate theuse of saliva as a diagnostic method for COVID-19 and highlight this biological uid's role in spreading the disease.© 2021 The Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd.

An autopsy study of the spectrum of severe COVID-19 in children: From SARS to different phenotypes of MIS-C

Background: COVID-19 in children is usually mild or asymptomatic, but severe and fatal paediatric cases have been described. The pathology of COVID-19 in children is not known; the proposed pathogenesis for severe cases includes immune-mediated mechanisms or the direct effect of SARS-CoV-2 on tissues. We describe the autopsy findings in five cases of paediatric COVID-19 and provide mechanistic insight into the mechanisms involved in the pathogenesis of the disease. Methods: Children and adolescents who died with COVID-19 between March 18 and August 15, 2020 were autopsied with a minimally invasive method. Tissue samples from all vital organs were analysed by histology, electron microscopy (EM), reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry (IHC). Findings: Five patients were included, one male and four female, aged 7 months to 15 years. Two patients had severe diseases before SARS-CoV-2 infection: adrenal carcinoma and Edwards syndrome. Three patients were previously healthy and had multisystem inflammatory syndrome in children (MIS-C) with distinct clinical presentations: myocarditis, colitis, and acute encephalopathy with status epilepticus. Autopsy findings varied amongst patients and included mild to severe COVID-19 pneumonia, pulmonary microthrombosis, cerebral oedema with reactive gliosis, myocarditis, intestinal inflammation, and haemophagocytosis. SARSCoV- 2 was detected in all patients in lungs, heart and kidneys by at least one method (RT-PCR, IHC or EM), and in endothelial cells from heart and brain in two patients with MIS-C (IHC). In addition, we show for the first time the presence of SARS-CoV-2 in the brain tissue of a child with MIS-C with acute encephalopathy, and in the intestinal tissue of a child with acute colitis. Interpretation: SARS-CoV-2 can infect several cell and tissue types in paediatric patients, and the target organ for the...(AU)

Fatal toxoplasmosis in a southern muriqui (Brachyteles arachnoides) from São Paulo state, Brazil: Pathological, immunohistochemical, and molecular characterization

We report the pathological, immunohistochemical, and molecular features of fatal acute systemic toxoplasmosis in an adult, female, free­living southern muriqui (Brachyteles arachnoides) from São Paulo state, Brazil. PCR­RFLP genotyping analysis identified the #21 genotype of Toxoplasma gondii. This represents the first report of acute toxoplasmosis involving this genotype in humans and animals.

Relatamos as características patológicas, imuno-histoquímicas e moleculares da toxoplasmose sistêmica aguda fatal em um muriqui do sul adulto (feminino) de vida livre (Brachyteles arachnoides) do estado de São Paulo, Brasil. A análise de genotipagem por PCR ­ RFLP identificou o genótipo # 21 de Toxoplasma gondii. Isso representa o primeiro relato de toxoplasmose aguda envolvendo esse genótipo em humanos e animais

Reference genes for studies in infectious parasitic diseases in five types of human tissues

Gene expression analyses based on messenger RNA (mRNA) expression require accurate data normalization. When using endogenous reference genes, these should be carefully validated. Validated reference genes vary greatly depending on tissue, cell subsets and experimental context. This study was aimed to identify reference genes that have more stable mRNA levels among individuals in peripheral blood mononuclear cells (PBMC); fresh skin biopsies; lung and brain autopsies as well as, skin biopsies formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE). Therefore, 6 endogenous reference genes were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction: 18S rRNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), TATA box-binding protein (TBP), beta-2-microbolin (B2M), ubiquitin C (UBC) and mitochondrially encoded ATP synthase 6 (MT-ATP6). Furthermore, validation of their stabilities and performance as reference genes was determined by geNorm and NormFinder programs. The results show that the most stable genes for PBMC and fresh skin biopsies were TBP and UBC; in FFPE lung autopsies and skin biopsies were GAPDH and B2M; and in FFPE brain autopsies were GAPDH and UBC. In addition, 18S rRNA was the least stable of all genes analyzed. These data concluded that even genes constitutively expressed have transcript level variations in different tissues as well as storage and experimental conditions. These observations suggest that suitable reference genes should be selected for normalization of gene expression data analysis.

As análises de expressão gênica baseadas na expressão do RNA mensageiro (mRNA) requerem normalização precisa dos dados. Ao usar genes de referência endógenos, estes devem ser cuidadosamente validados. Os genes de referência validados variam muito, dependendo do tecido, subconjuntos de células e contexto experimental. Este estudo teve como objetivo identificar genes de referência que apresentam níveis de mRNA mais estáveis ​​entre indivíduos em células mononucleares do sangue periférico (PBMC); biópsias de pele fresca; autópsias pulmonares e cerebrais, bem como biópsias de pele fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE). Portanto, 6 genes de referência endógenos foram avaliados por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real: rRNA 18S, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteína de ligação à caixa TATA (TBP), beta-2-microbolina (B2M), ubiquitina C (UBC) e ATP sintase 6 mitocondrialmente codificada (MT-ATP6). Além disso, a validação de suas estabilidades e desempenho como genes de referência foi determinada pelos programas geNorm e NormFinder. Os resultados mostram que os genes mais estáveis ​​para PBMC e biópsias de pele fresca foram TBP e UBC; nas autópsias pulmonares de FFPE e biópsias de pele foram GAPDH e B2M; e nas autópsias cerebrais de FFPE foram GAPDH e UBC. Além disso, o 18S rRNA foi o menos estável de todos os genes analisados. Esses dados concluíram que mesmo os genes expressos constitutivamente apresentam variações no nível de transcrição em diferentes tecidos, bem como condições experimentais e de armazenamento. Essas observações sugerem que genes de referência adequados devem ser selecionados para normalização da análise dos dados de expressão gênica.

Comparative study of five commercial probes for the detection of Epstein-Barr virus (EBV) by in situ hybridization in cases of nodular sclerosis Hodgki's lymphoma / Estudo comparativo de cinco sondas comerciais para detecção do vírus Epstein-Barr (EBV) por hibridização in situ em casos de linfoma de Hodgkin esclerose nodular

ABSTRACT Introduction: Epstein-Barr virus (EBV) may serve as a target in therapeutic treatments, thus reliable diagnostic results are necessary. Objective: The aim of this study was to evaluate the accuracy of EBV detection by in situ hybridization (ISH) using five commercial probes in formalin-fixed and paraffin-embedded samples of nodular sclerosis Hodgkin's lymphoma (HL), and to compare the results with immunohistochemistry (IHC) and polymerase chain reaction (PCR). Material and method: Thirty samples were selected, 28 were lymph nodes, one bone marrow and one mediastinum. The following parameters were analyzed: signal intensity; proportionality of positive cells; quality of the reaction according to comfort for evaluation, sign quality and homogeneity of labeled cells; background reaction; morphology; presence of artifacts; and positivity in other non-neoplastic cells. All samples were analyzed for EBV detection using the five probes, IHC for latent membrane protein type 1 (LMP1) and PCR for Epstein Barr virus nuclear antigen 1 (EBNA1). Statistical analyses were performed with the R1 software; Fleiss' test and Cohen Kappa index of 5% were considered significant. Results: The detection by IHC-LMP1 was 26.7% (8/30) and 66.7% (20/30) by PCR-EBNA1. All probes detected EBV. Positivity was observed in 42/90 (46.7%), 38/90 (42.2%), 45/90 (50%), 27/90 (30%) and 61/90 (67.8%) for probes A, B, C, D and E, respectively. Discussion: All five probes demonstrated positivity. Conclusion: Probe E showed better rate (67.8%), sensitivity, specificity and accuracy (100%), a very good correlation among the different observers and with PCR, besides great cost-benefits relation.

RESUMO Introdução: O vírus Epstein-Barr (EBV) pode servir como alvo nos tratamentos terapêuticos, sendo necessário resultado diagnóstico confiável. Objetivo: Avaliar a acurácia da detecção do EBV pela hibridização in situ (ISH), utilizando cinco sondas comerciais em amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina de linfoma de Hodgkin (LH) esclerose nodular, comparando os resultados com a imuno-histoquímica (IHQ) e a reação em cadeia pela polimerase (PCR). Material e método: Trinta amostras foram selecionadas, sendo 28 linfonodos, uma medula óssea e um mediastino. Os seguintes parâmetros foram analisados: intensidade do sinal; proporcionalidade das células positivas; qualidade da reação de acordo com o conforto na avaliação, qualidade do sinal e homogeneidade das células marcadas; reação de fundo; morfologia; presença de artefatos; e positividade em outras células não neoplásicas. Todas as amostras foram analisadas para a detecção do EBV usando as cinco sondas, IHQ para proteína da membrana latente tipo 1 (LMP1) e PCR para antígeno nuclear do EBV (EBNA1). As análises estatísticas foram realizadas com o software R1; os índices de 5% para Kappa de Fleiss e Cohen foram considerados significantes. Resultados: A detecção pela IHQ-LMP1 foi de 26,7% (8/30) e 66,7% (20/30) pela PCR-EBNA1. Todas as sondas detectaram EBV. A positividade foi observada em 42/90 (46,7%), 38/90 (42,2%), 45/90 (50%), 27/90 (30%) e 61/90 (67,8%) para as sondas A, B, C, D e E, respectivamente. Discussão: Todas as sondas demonstraram positividade. Conclusão: A sonda E mostrou melhor taxa (67,8%), sensibilidade, especificidade e precisão (100%), boa correlação entre os diferentes observadores e com a PCR, além de ótimo custo/benefício.

Genotyping of toxoplasma gondii: DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues from AIDS patients who died by severe disseminated toxoplasmosis

This study investigated the genetic features of T. gondii isolated directly in autopsies of HIV-infected patients who died with severe disseminated toxoplasmosis. This retrospective analysis was conducted in a cohort of 15 HIV-infected patients with clinical and laboratory data. They had previous cerebral toxoplasmosis at least 6 months before the disseminated toxoplasmosis episode. The hypothesis was that they were infected with highly virulent parasites due to the condition in which they died. T. gondii genotyping was done directly in DNA extracted from 30 autopsy brain and lung samples (2 per patient) and mutilocus PCR-RFLP genotyping was done using 12 molecular markers. The 30 clinical samples were genotyped successfully in 8 or more loci and six suggestive genotypes were identified. One of them was Toxo DB #11, previously identified in different domestic animals and virulent in experimental animals. The other five suggestive genotypes...(AU)

Identification of Leishmania spp. promastigotes in the intestines, ovaries, and salivary glands of Rhipicephalus sanguineus actively infesting dogs

Sand flies are recognized as the major vector of canine visceral leishmaniasis. However, in some areas of Brazil where sand flies do not occur, this disease is found in humans and dogs. There has been speculation that ticks might play a role in transmission of canine visceral leishmaniasis and the DNA of Leishmania spp. has been reported in whole ticks. We investigated the presence of Leishmania spp. promastigotes in the intestines, ovaries, and salivary glands of Rhipicephalus sanguineus ticks collected from tick-infested dogs in two cities of Brazil. We used 66 dogs that tested positive and 33 that tested negative for Leishmania spp. according to direct cytological examination assays. Ten ticks were collected from each dog and dissected to collect the intestines, ovaries, and salivary glands for immunohistochemistry (IHC) and diagnostic real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). IHC results showed Leishmania spp. in 98, 14, and 8 % of the intestines, ovaries, and salivary glands, respectively. Real-time PCR showed that 89, 41, and 33 % of the tick intestine, ovary, and salivary glands, respectively, were positive for Leishmania spp. The verification of promastigotes of Leishmania spp. by two independent techniques in ticks collected from these urban region dogs showed that there is need for clarification of the role of ticks in the transmission of canine visceral leishmaniasis in Brazil.

Avaliação de anticorpos monoclonais como marcadores diferenciais de meningites bacterianas e virais por meio de técnica imuno-histoquímica / Investigation on the monoclonal antibodies as differential markers for viral and bacterial meningitis by means of immnunohistochemistry technique

Desde 1996, o Laboratório de Anticorpos Monoclonais, Antígenos e Adjuvantes - Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz (CI-IAL) tem desenvolvido trabalhos na caracterização antigênica de cepas de Neisseria meningitidis utilizando-se painel de anticorpos monoclonais(AcMo) pré-estabelecido, e produção de novos monoclonais para a análise de cepas com perfis desconhecidos. AcMo foram obtidos das diferentes fusões realizadas no laboratórioutilizando-se células esplênicas e linfonodos poplíteos. Dois hibridomas murinos secretores de AcMo anti-N. meningitidis produzidos e caracterizados no CI-IAL têm sido avaliados por meio de estudo imuno-histoquímico (IHQ) no Centro de Patologia-Laboratório de Imunohistoquímica-IAL. Com a padronização da reação, estabeleceu-se um protocolo para efetuar apesquisa de antígenos de N. meningitidis por IHQ. Houve melhoria no diagnóstico histopatológicoda meningite meningocócica, sobretudo em situações em que não há confirmação da presença do microorganismo por técnicas biomoleculares, como PCR, utilizando-se AcMo específicos para antígenos de diferentes sorogrupos, sorotipos e subtipos de N. meningitidis. O resultado obtido nos primeiros testes mostrou-se promissor, e os dois AcMo demonstraram excelentesresultados. Não houve reatividade cruzada com meningite viral, S. pneumoniae, Rickettsia ou rubéola. Nos próximos estudos, é fundamental ampliar número de amostras, incluindo-se aquelas coletadas de pacientes com meningites meningocócicas e de indivíduos infectados com outros agentes patogênicos.

Since 1996, the Laboratory of Monoclonal Antibodies, Antigens and Adjuvants - Immunology Center of the Adolfo Lutz Institute (CI-IAL) has been developing works on the antigenic characterization of strains of Neisseria meningitidis using pre-established panel of monoclonal antibodies (AcMo) And production of new monoclonals for the analysis of strains with unknown profiles. AcMo were obtained from the different fusions performed in the laboratory using splenic and popliteal lymph nodes. Two murine hybridomas secreting anti-N mAb. Meningitidis produced and characterized in CI-IAL have been evaluated by means of an immunohistochemical study (IHC) at the Center for Pathology-Laboratory of Immunohistochemistry-IAL. With the standardization of the reaction, a protocol was established to carry out research of antigens of N. meningitidis by IHC. There was improvement in the histopathological diagnosis of meningococcal meningitis, especially in situations where there is no confirmation of the presence of the microorganism by biomolecular techniques, such as PCR, using specific mAbs specific for antigens of different serogroups, serotypes and subtypes of N. meningitidis. The results obtained in the first tests proved to be promising, and the two MAbs demonstrated excellent results. There was no cross reactivity with viral meningitis, S. pneumoniae, Rickettsia or rubella. In the next studies, it is essential to expand the number of samples, including those collected from patients with meningococcal meningitis and from individuals infected with other pathogens.

Investigation on the monoclonal antibodies as differential markers for viral and bacterial meningitis by means of immnunohistochemistry technique / Avaliação de anticorpos monoclonais como marcadores diferenciais de meningites bacterianas e virais por meio de técnica imuno-histoquímica

Since 1996, the Laboratory of Monoclonal Antibodies Antigens and Adjuvants - Immunology Center of Adolfo Lutz Institute (IC-IAL) has been working on N. meningitidis strains antigens characterization by using a predetermined monoclonal antibodies (MoAb) panel; and the new monoclonal production has been performed for characterizing strains with unknown profiles. MoAb were obtained from different fusions performed at IAL using spleen cells and popliteal lymph nodes. Two murine hybridomas secreting MoAb anti-N. meningitidis antigens, produced and characterized in the Laboratory of IC-IAL, are presently being evaluated by immunohistochemical (IHC) technique at Immunohistochemistry Laboratory - Pathology Center, IAL. After standardizing these reactions, a protocol for performing investigation on N.meningitidis antigens by using IHQ was established. An increment in the histopathological diagnosis of meningococcal meningitis was occurred, by using MoAb specific for antigens from N. meningitidis serogroups, serotypes and subtypes, mainly in those cases without microorganisms confirmation by biomolecular techniques as PCR. The results obtained in these first tests proved to be promising, and two MoAb showed excellent results. No cross-reactivity with viral meningitis, S. pneumoniae, Rickettsia or Rubella was detected. For the further studies, it is fundamental to increase the samples size, including samples from patients with meningococcal meningitis and from individuals infected with other pathogens.

Desde 1996, o Laboratório de Anticorpos Monoclonais, Antígenos e Adjuvantes - Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz (CI-IAL) tem desenvolvido trabalhos na caracterização antigênica de cepas de Neisseria meningitidis utilizando-se painel de anticorpos monoclonais (AcMo) pré-estabelecido, e produção de novos monoclonais para a análise de cepas com perfis desconhecidos. AcMo foram obtidos das diferentes fusões realizadas no laboratório utilizando-se células esplênicas e linfonodos poplíteos. Dois hibridomas murinos secretores de AcMo anti-N. meningitidis produzidos e caracterizados no CI-IAL têm sido avaliados por meio de estudo imuno-histoquímico (IHQ) no Centro de Patologia-Laboratório de Imunohistoquímica-IAL. Com a padronização da reação, estabeleceu-se um protocolo para efetuar a pesquisa de antígenos de N. meningitidis por IHQ. Houve melhoria no diagnóstico histopatológico da meningite meningocócica, sobretudo em situações em que não há confirmação da presença do microorganismo por técnicas biomoleculares, como PCR, utilizando-se AcMo específicos para antígenos de diferentes sorogrupos, sorotipos e subtipos de N. meningitidis. O resultado obtido nos primeiros testes mostrou-se promissor, e os dois AcMo demonstraram excelentes resultados. Não houve reatividade cruzada com meningite viral, S. pneumoniae, Rickettsia ou rubéola. Nos próximos estudos, é fundamental ampliar número de amostras, incluindo-se aquelas coletadas de pacientes com meningites meningocócicas e de indivíduos infectados com outros agentes patogênicos.

Fatal Human herpesvirus 1 (HHV-1) infection in captive marmosets (Callithrix jacchus and Callithrix penicillata) in Brazil: clinical and pathological characterization / Infecção fatal por Herpesvirus simplex Tipo 1 (HHV-1) em saguis de cativeiro (Callithrix jacchus and Callithrix penicillata) no Brasil: caracterização clínica e patológica

Fatal Human herpesvirus 1 (HHV-1) was diagnosed in 12 captive marmosets (Callithrix jacchus and Callithrix penicillata) from metropolitan region of São Paulo, São Paulo State. Clinical signs were variable among the cases, but most affected marmosets presented signs associated with viral epithelial replication: oral, lingual and facial skin ulcers and hypersalivation, and viral replication in the central nervous system: prostration, seizure and aggressive behavior. Consistent microscopic findings were diffuse mild to severe nonsuppurative necrotizing meningoencephalitis with gliosis, vasculitis and neuronal necrosis. Additionally, in the brain, oral cavity, skin, adrenal gland and myoenteric plexus intranuclear inclusion bodies were present. Immunohistochemistry confirmed the presence of the HHV-1 antigen in association with lesions in the brain, oral and lingual mucosa, facial skin, adrenal gland and myoenteric plexus. HHV-1-specific polymerase chain reaction (PCR) analysis of the brain was carried out and the virus was detected in 7/8 infected marmosets. It is concluded that HHV-1 causes widespread fatal infection in marmosets.(AU)

Infecção fatal por Herpesvirus simplex Tipo 1 (HHV-1) foi diagnosticada em 12 saguis de cativeiro (Callithrix jacchus e Callithrix penicillata) provenientes da região metropolitana de São Paulo, Estado de São Paulo. Os sinais clínicos foram variáveis entres os casos, no entanto, a maioria dos saguis afetados apresentavam sinais associados à replicação viral em epitélios: úlceras na cavidade oral, língua e pele da face e hipersalivação; e no sistema nervoso central: prostração, convulsão e comportamento agressivo. Histologicamente, o principal achado foi meningoencefalite necrosante não supurativa difusa, leve a acentuada com gliose, vasculite e necrose neuronal. Inclusões intranucleares também foram observadas em encéfalo, cavidade oral, pele, glândula adrenal e plexo mioentérico. A imuno-histoquímica anti-HHV-1 confirmou a presença do antígeno viral em associação às lesões em encéfalo, mucosa oral e lingual, pele da face, glândula adrenal e plexo mioentérico. Em 7/8 saguis infectados foi detectada a presença de HHV-1 por reação em cadeia da polimerase (PCR) a partir de amostras de encéfalo. Conclui-se que HHV-1 causa uma infecção disseminada e fatal em saguis.(AU)

Adenocarcinoma renal metastático em uma Codorna Japonesa (Coturnix coturnix japonica) / Metastatic renal adenocarcinoma in a Japanese Quail (Coturnix coturnix japonica)

Uma codorna japonesa (Coturnix coturnix japonica), fêmea, adulta com 2 anos apresentou parada de postura, emagrecimento, aumento de volume abdominal e morte. Ao exame macroscópico, observou-se ascite, pulmão esquerdo difusamente esbranquiçado, massas esbranquiçadas, de aproximadamente 1,0cm de diâmetro, na região caudal do lobo direito do fígado e na serosa da moela; massas de 0,1 a 0,5cm no mesentério e serosa intestinal; e uma massa de 5,0x2,0cm na fossa do sinsacro, que acometia 90 por cento do parênquima renal e estendia-se ao ovário e oviduto. Na avaliação histopatológica da neoformação renal, observou-se proliferação de células epiteliais formando túbulos, que muitas vezes não apresentavam lúmen, sustentados por um estroma fibrovascular escasso associado à necrose multifocal. As células neoplásicas eram cuboidais, núcleos redondos a ovalados, nucléolos evidentes, citoplasma abundante e eosinofílico, pleomorfismo moderado e poucas figuras mitóticas. Metástases foram observadas de forma difusa no ovário, oviduto e pulmão esquerdo; multifocal na serosa do intestino e focal no fígado e camadas muscular e serosa da moela. Na avaliação imuno-histoquímica, as células tumorais foram positivas para a citoqueratina (clones AE1+AE3) e negativas para a citoqueratina 5/6, o CD10 e a fosfatase alcalina placentária. De acordo com a localização, achados morfológicos e o perfil imuno-histoquímico, conclui-se que o presente relato trata-se de um adenocarcinoma renal metastático.

A 2-year-old Japanese quail (Coturnix coturnix japonica), female, which stopped egg production presented: weight loss, increased abdominal volume, and death. Macroscopically, it was observed: ascites, whitish left lung, whitish masses measuring 1.0cm in diameter in the caudal right lobe of the liver and in the gizzard serosa; 0.1-0.5cm masses in the mesentery and intestinal serosa; and a 5.0x2.0cm mass in synsacral area that encompassed 90 percent of the renal parenchyma and part of ovary and oviduct. Histologically, epithelial cells proliferation with formation of tubules, sometimes without lumen supported by mild fibrovascular stroma and multifocal necrosis was observed in the renal mass. The neoplastic cells were cuboidal, with round to oval nuclei, and evident nucleolus, abundant eosinophilic cytoplasm, moderated pleomorphism. Mitotic figures were rare. Metastasis was seen diffuse in ovary, oviduct, left lung, multifocal in intestinal serosa, focal in liver and serosal and muscular layer in gizzard. Immunohistochemically, tumors cells were positive for cytokeratin (clones AE1+AE3) and negative for cytokeratin 5/6, CD10 and placental alkaline phosphatase. According to localization, morphology features and immunohistochemistry evaluation, the present study reports a metastatic renal adenocarcinoma.

Principais processos neoplásicos encontrados em psitacídeos mantidos em cativeiro / Main neoplasic processes in psittacines birds kept in captivity

Um estudo anatomopatológico envolvendo 130 psitacídeos oriundos de centros de triagens, zoológicos e criadouros, visando a determinação da causa de morte destes animais, revelou a presença de neoplasias em sete animais, totalizando 5,4 por cento dos casos. Os processos neoplasicos foram caracterizados como colangiocarcinoma, colangioma, linfoma, hemangiossarcoma e carcinoma renal primário, sendo o colangiocarcinoma o mais freqüentemente encontrado, presente em três animais. Este trabalho descreve estas neoplasias, levando em consideração os aspectos macro e microscópicos, meios de diagnósticos e espécies acometidas.

An anatomopathologic study of 130 captivy psittacines from zoos, breeders and rehabilitation centers showed the presence of neoplastic disease in seven birds, totalizing 5.4 percent of the cases. The neoplasms were identified like cholangiocarcinoma, cholangioma, lymphoma, haemangiosarcoma and renal cell carcinoma. The cholangiocarcinoma was the tumor most commonly observed. it was present in birds. This study describes the macro and microscopic findings of these tumors; also reports diagnostic methods employed to identify these neoplasms.

A molecular analysis and long-term follow-up of two siblings with severe congenital hypothyroidism carrying the IVS30+1G>T intronic thyroglobulin mutation / Análise molecular e acompanhamento a longo prazo de dois irmãos com hipotireoidismo congênito portadores da mutação intrônica IVS30+1G>T no gene da tireoglobulina

OBJECTIVE: To extend the molecular analysis of the IVS30+1G>T intronic thyroglobulin (TG) mutation, and to report the eleven year follow-up of the affected patients. METHOSD: Two siblings with severe congenital hypothyroidism with fetal and neonatal goiter, harboring the IVS30+1G>T mutation were included. Nodular and non-nodular thyroid tissue specimens were collected. Specific thyroid genes expression was evaluated by real-timePCR and by immunohistochemistry. RESULTS: In non-nodular tissue specific thyroid genes mRNA were reduced when compared to normal thyroid sample. In the nodule, TPO and NIS expression was very low. Microscopic examinations showed very large follicular-lumina and swollen vesicles of endoplasmatic-reticulum. Strong cytoplasmatic and low follicular-lumen TG immunostaining were detected. Intracellular NIS, membrane TPO and TSHR immunostaining had higher positivity in non-nodular sample. Both patients had a long-term adequate developmental outcome, besides one patient have been lately-treated. CONCLUSIONS: IVS30+1G>T mutation not only lead to very enlarge endoplasmatic-reticulum, but also to alterations of specific thyroid genes expression. The clinical evolution of patients harboring these mutations strengthen the concept of the influence of environment, like iodine nutrition, to determine the final phenotypic appearance.

OBJETIVO: Aprofundar a análise molecular da mutação intrônica IVS30+1G>T do gene tireoglobulina (TG) e relatar a clínica de pacientes portadores da mutação, acompanhados por 11 anos. MÉTODOS: Foram estudados dois irmãos com hipotireoidismo congênito grave com bócio fetal e bócio neonatal, portadores da mutação IVS30+1G>T. Foram coletadas amostras de tecido nodular e não-nodular. Avaliou-se a expressão de genes específicos da tireóide por PCR em tempo real e imunohistoquímica. RESULTADOS: A expressão de genes específicos da tireóide foi menor no tecido não-nodular que no tecido normal controle. Expressões de TPO e NIS foram extremamente baixas no tecido nodular. Verificou-se lúmen folicular aumentado com grandes vesículas de retículo endoplasmático, e detectou-se forte marcação de TG no citoplasma e fraca no lúmen folicular. No tecido não-nodular observou-se forte positividade de NIS intracelular e, TPO e TSHR na membrana plasmática. O acompanhamento em longo prazo dos pacientes mostrou adequado desenvolvimento, apesar de um deles ter recebido tratamento tardio. CONCLUSÕES: A mutação IVS30+1G>T não só promove alterações no retículo endoplasmático, como alterações na expressão de genes específicos da tireóide. A evolução clínica destes pacientes reforça o conceito da influência do meio ambiente, como o aporte nutricional de iodo, no fenótipo final.

Análise de indicadores internos e externos relevantes à resolutividade diagnóstica em laboratório de referência em imuno-histoquímica / Analysis of internal and external factors potentially relevant to the diagnosis in immunohistochemistry in a public reference laboratory

OBJETIVO: Avaliar a resolutividade da imuno-histoquímica (IHQ) no diagnóstico de neoplasias em um laboratório de referência da rede de saúde pública e determinar potenciais influências da comunicação entre a fonte requisitante e o laboratório executante sobre tal resolutividade. MATERIAL E MÉTODOS: Mil casos oncológicos oriundos de oito hospitais públicos foram submetidos a exame IHQ, sendo 500 imediatamente anteriores e 500 posteriores à intervenção para aprimoramento da comunicação entre os requisitantes e o laboratório de IHQ. A recuperação de antígenos foi realizada pelo calor úmido sob pressão, e o sistema de detecção foi o LSAB plus System. Os resultados foram expressos como positivo, negativo ou inconclusivo. Foram coletadas informações sobre recebimento do bloco de parafina e fixador utilizado, guia de requisição de serviços de diagnóstico e terapia (SADT), laudo anatomopatológico original, topografia, idade e sexo do paciente. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Foram coradas 5.719 lâminas pela IHQ de 989 casos considerados. A IHQ mostrou-se resolutiva em 919/989 (92,9 por cento) casos. O número de antígenos por caso variou de um a 22, com média de 5,8 marcadores. A pesquisa de até cinco antígenos resolveu 534 casos e foram necessários até 10 marcadores para esclarecer 919 casos. Ainda hoje, informações básicas, como laudo anatomopatológico, idade e sexo do paciente, topografia, hipótese diagnóstica precisamente exposta, fixador e blocos de parafina em boas condições nem sempre são disponibilizadas aos laboratórios de referência. O aprimoramento dessa comunicação é essencial para a racionalização do fluxo dos exames IHQ e o incremento na qualidade da conclusão diagnóstica.

OBJECTIVES: The aim of this study was to evaluate the resolutivity of immunohistochemical (IHC) assays on neoplastic samples in a public health laboratory and to assess the influence of communication between the requiring institution and reference one on the quality of the IHC diagnosis. MATERIAL AND METHODS: One thousand oncological samples from eight public hospitals were submitted to IHC assay: 500 immediately before and 500 after an intervention demanding further information from the requiring pathologist. Antigen retrieval was performed in a pressure cooker and the detection system was LSAB plus System. The results were expressed as positive, negative or inconclusive. Information about paraffin blocks, fixatives, official requiring form, the attachment of original anatomopathological report, topography of the lesion, age and gender of the patients was collected. RESULTS AND CONCLUSION: From 989 samples, 5,719 slides were stained by IHC, leading to a resolutivity for 919/989 (92.9 percent). The number of antigen tested ranged from one to 22 - average of 5.8 for case. Panels with up to five antigens per case resolved 534 samples, whereas up to 10 markers were necessary to resolve 919 samples. Even nowadays, basic information, such as anatomopathological reports, age, gender, representative and technically superior paraffin block are not always available to the reference laboratory. The improvement of such communication is essential to rationalize the flux of immunohistochemical tests and to enhance the quality of diagnostic conclusions.

Experimental chronic granulomatous inflammatory process in fish: a morphological, ultrastructural anel immunocytochemical study

The purpose of the present srudy was to evaluate the chronic granulomatous inflammatory process experimentally induced in Oreochromis niloticus by the inoculation ofBCG and to clarify aspects of the inflammatory reaction in fish for a better understanding of the phylogeny of the process. Results obtained by light microscopy and ultrastructural analysis showed the participation of macrophages, thrombocytes, lymphocytes, eosinophils, plasma cells and foreign type giant cells in the inflammatory process. Besides these cell types, a granulomatous reaction mainly consisting of epithelioid cells was also observed ultrastrucrurally. These epithelioid cells developed desmosomes throughout the experiment, and also began to express receptors for cytokeratin. Both findings are immunocytochemicaliy characteristic of epithelial cells. Pigment cells (melanomacrophages) could also be seen surrounding ali the granulomatoid formation in a crescent fashion and participating in the chronic granulomatous inflammatory reaction.

O objetivo do presente estudo foi avaliar o processo inflamatório crônico granulomatoso induzido experimentalmente em Oreochromis niloticus através da inoculação de BCG e elucidar aspectos da reação inflamatória em peixes para uma melhor compreensão da filogenia do processo. Os resultados obtidos por microscopia de luz comum e ultra-estrutural demonstraram a participação de macrófagos, trombócitos, linfócitos, eosinófilos, células plasmáticas e células gigante tipo corpo estranho no processo inflamatório. Além desses tipos celulares, uma reação granulomatosa constituída predominantemente de células epitelióides também foram observadas ultraestruturalmente. Essas células epitelióides desenvolveram desmossomos ao longo do experimento, e também passaram a expressar receptores para citoqueratina, características estas de células epiteliais. Células pigmentares (melanomacrófagos), envolvendo de maneira crescente toda a formação granulomatóide e, participando ativamente da reação inflamatória crônica granulomatosa.

Expressão de galectina-3 e citoqueratina 19 nas neoplasias epiteliais da glândula tireóidea e correlação histopatológica / Expression of galectin-3 and cytokeratin 19 in the epithelial neoplasm of the thyroid gland and histopathological correlation

INTRODUÇAO: O câncer da glândula tireóidea é caracterizado pela sua variedade clínica e patológica. O difícil diagnóstico pré-operatório das lesões foliculares induz a mais procedimentos cirúrgicos de caráter diagnóstico do que propriamente terapêutico. A proposta deste estudo foi identificar a expressão imuno-histoquímica das neoplasias epiteliais tireóideas utilizando anticorpos monoclonais para galectina-3 e citoqueratina 19 e correlacioná-la com variáveis histopatológicas. MATERIAL E MÉTODO: A expressão da galectina-3 e da citoqueratina 19 foi estudada imuno-histoquimicamente em 84 casos com diagnóstico de tecido normal (n = 10), bócio adenomatoso (n = 8), adenoma folicular (n = 12), adenoma de célula de Hürthle (n = 3), carcinoma papilífero (n = 29), carcinoma folicular (n = 8), carcinoma insular (n = 4), carcinoma de células de Hürthle (n = 4) e carcinoma indiferenciado (n = 6), selecionados a partir de pacientes operados no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Heliópolis (HOSPHEL), no período de 1984 a 1995. RESULTADOS: A expressão da galectina-3 foi observada em bócio adenomatoso (12,5 por cento), adenoma folicular (16,7 por cento), carcinoma papilífero (96,6 por cento), carcinoma folicular (12,5 por cento), carcinoma insular (50 por cento), carcinoma de célula de Hürthle (100 por cento) e carcinoma indiferenciado (50 por cento). Nossos resultados confirmaram a expressão significativa da galectina-3 no grupo das neoplasias malignas, principalmente no carcinoma papilífero. O padrão de expressão da citoqueratina 19 foi diferente entre os tipos de lesão: enquanto nos bócios e adenomas mostrou-se fraco, nos carcinomas papilíferos foi forte e difuso. CONCLUSAO: Associadas, a galectina-3 e a citoqueratina 19 auxiliam o diagnóstico histopatológico, principalmente nas lesões de interpretação duvidosa, além de evidenciarem atipias e, com isso, determinarem uma lesão suspeita.

Controle de qualidade interlaboratorial em imuno-histoquímica: citoceratinas e receptor de estrógeno como modelos / Interlaboratorial quality-control in immunohistochemistry: cytokeratins and estrogen receptors as models

INTRODUÇAO: O grande incremento do uso da imuno-histoquímica (IHQ) em numerosos laboratórios de anatomia patológica amplia o poder de resolução diagnóstica, mas traz certo grau de heterogeneidade de procedimentos e resultados. Seguindo recentes propostas da literatura internacional, participantes do Clube de IHQ da Sociedade Brasileira de Patologia desenvolvem ações de controle de qualidade, aplicando protocolos de sua rotina à pesquisa de antígenos que sirvam como indicadores de qualidade da reação. MATERIAL E MÉTODO: Um total de dez laboratórios participou das duas etapas deste estudo, cujos marcadores foram pancitoceratinas e receptores de estrógeno. Com lâminas controle recebidas dos laboratórios, cada participante efetuou a técnica de IHQ conforme sua prática diária, retornando as lâminas juntamente com o formulário de procedimento. A avaliação semiquantificada de 0 a 4 da intensidade da reação específica e de 0 a 3 da coloração de fundo e da qualidade da técnica histológica foram atribuídas individual e sigilosamente durante a projeção em data show em reunião do Clube de IHQ, gerando um escore final. RESULTADOS E DISCUSSAO: As variações na imunocoloração de citoceratinas e receptor de estrógeno não comprometeram sua detecção nas lâminas preparadas nos diversos laboratórios. Tais variações associaram-se à diversidade de sistemas de recuperação antigênica e de amplificação, resultando ora em imunopositividade menos intensa, ora em maior fundo. Outros estudos devem abordar questões de interpretação, incluindo-se critérios para semiquantificação.

Imunoexpressäo da proteína Her-2 em punçäo aspirativa com agulha fina de carcinoma de mama: correlaçäo com os achados da peça cirúrgica / Immunoexpression of Her-2 protein in fine-needle aspirates of breast carcinoma: correlation with surgical specimens

Objetivo: avaliar a imunoexpressäo da proteína HER-2 em punçäo biópsia aspirativa de carcinoma de ductos infiltrantes da mama e nos espécimes cirúrgicos correspondentes. Correlacionar a imunoexpressäo da proteína HER-2 com o grau histológico. Método: foram examinados 48 esfregaços fixados em álcool, previamente corados pela técnica de Papanicolaou, e cortes histológicos de blocos de parafina do tecido correspondente. Todos foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica, utilizando o método da avidina-biotina-peroxidase com um anticorpo policlonal (A0485-Dako). As reações foram realizadas simultaneamente com recuperaçäo antigênica. A avaliaçäo dos resultados foi feita por método semiquantitativo, segundo a graduaçäo do HercepTest. Foram considerados positivos apenas os casos graduados em 3+. Resultados: observou-se positividade de 39,6 por cento nos esfregaços e 35,4 por cento nos cortes histológicos respectivos, sendo a concordância cito-histológica nos casos positivos quase perfeita (kappa 0,82). A utilizaçäo do método de avaliaçäo dos cortes histológicos mostrou-se reprodutível nos esfregaços e padronizou a interpretaçäo dos resultados. A correlaçäo entre a positividade para proteína HER-2 e o grau histológico näo foi significante, mas houve tendência a imunoexpressäo mais freqüente em tumores menos diferenciados. Conclusäo: a positividade das reações imunocitoquímicas nos esfregaços foi comparável à obtida nos cortes histológicos, podendo portanto o material de punçäo aspirativa por agulha fina, previamente corado pela técnica de Papanicolaou, ser utilizado na avaliaçäo da imunoexpressäo da proteína HER-2